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生物剖析能力是药物临床前研究和临床研究的基石能力，是尊龙凯时这类CRO机构助力海内外客户顺遂推进药物开发历程的手艺基础。生物剖析虽然是一门手艺性很强实践性很强的事情领域，若是仅就剖析看剖析，仅就手艺自己思索手艺关于研发历程中遇到种种情形和问题的解决可能会带来思绪上的局限性。做好生物剖析事情，离不开手艺实践，更离不开相关基础理论知识的支持，实践反响理论，理论指导实践，一些基础理论不但具指导价值，有时也具启发性，有利于广拓视角。尊龙凯时美研小编团队推出生物剖析系列专栏，约请本事域的资深专业职员从差别的视角笔谈生物剖析相关的话题。
现在热门和已上市的核酸药物主要包括mRNA和寡核苷酸两大类，mRNA既可以作为为疫苗，又可以作为治疗性药物，需要差别性地思量其PK/PD的评预战略 ；寡核苷酸现在成药的主要是ASO和siRNA，这些核酸药物又兼顾了小分子与大分子药物的一些PK/PD特征。
基因治疗现在有多个差别层面的明确，狭义基因治疗一样平常界说是使用正常的基因替换、纠正异常的基因，或者将异常的基因敲除以抵达治疗疾病的目的� ；谥行墓嬖蛏先ッ魅�，狭义的基因治疗也可以从另一个层面界说为通过纠正中心规则历程中泛起的问题，如基因突变导致的功效性卵白质缺失或异常等（拜见图1和图2），以抵达治疗疾病的目的。在广义的基因治疗看法下，溶瘤病毒、细胞治疗，核酸类药物均可被纳入基因治疗的领域，但并不是所有的核酸药物都属于基因治疗领域，如mRNA药物仅有一部分可以被纳入基因治疗的领域。
图1. 基因突变影响开放阅读框而不可形成有功效的卵白
图2. 部分寡核苷酸药物针对的遗传病
现在的基因治疗领域有两个离不开核酸的有趣的征象，即RNA滋扰和CRISPR基因编辑。RNA滋扰和CRISPR基因编辑也都是一种生物体内抗病毒熏染的免疫机制，是在核酸水平上的免疫，有人称其为基因免疫或基因组免疫。而经典的免疫学里涉及的免疫系统中的免疫分子包括抗体、补体、配体、受体和细胞因子等因素一样平常都是氨基酸为基本组成单位的分子，没有核苷酸作为基本组分的分子的直接加入。
未来是否有更多类似于RNA滋扰和基因编辑的核酸层面的机制被掘客而可能会进一步地富厚我们对免疫学的认知，并且在基因组免疫领域的看法会越来越富厚、生长，甚至逐步成为免疫学的一大分支，或许也能作为尊龙凯时一种特殊期待。
核酸药物经由几十年的积累，在近几年抵达了爆发期。现在海内外上市的基因治疗药物主要是mRNA疫苗和主要针对遗传病的寡核苷酸类药物（如图3）。以是本文主要将核酸类药物分为mRNA药物和寡核苷酸药物两类，划分举行简要叙述。
图3. 国际上市的主要核酸类药物（阻止2023年3月，暂未列海内厂家产品）
mRNA药物的优势包括：
（1）可以导入细胞，在体内直接表达目的卵白 ；
（2）mRNA的降解通详尽胞正常代谢完成，无显着的毒性 ；
（3）既能刺激体液免疫，又能刺激细胞免疫应答 ；
（4）既可以开发为疫苗，又可以开发为治疗性药物等。
mRNA药物的弱点包括：
（1）不稳固，易被核酸酶等降解 ；
（2）制备工艺重大 ；
（3）使用纯生物药的生产路径 ；
（4）需要超低温运输等。
制订mRNA产品临床前药代动力学药效学（PK/PD）考察剖析战略的条件是判断其属于疫苗照旧治疗性药物。两者保存以下差别：
（1）编码卵白的性子差别，mRNA疫苗编码病毒或肿瘤抗原卵白，一样平常少量卵白表达就可以施展作用, 治疗性药物则通常需要更高的卵白表达量 ；
（2）递送要求差别，疫苗无需组织特异性，mRNA治疗性药物则期望递送到特定的组织后举行翻译表达 ；
（3）给药方法差别，现在上市和在研mRNA疫苗多为肌肉注射，治疗性药物则凭证详细治疗性子常接纳系统给药，甚至靶组织局部给药 ；
（4）遵照的规则差别，mRNA疫苗需要遵照疫苗的指导原则，免疫原性属于其PD指标，而治疗性药物则差别的遵照，免疫原性也非是研发者所期望。
mRNA疫苗可以在细胞内表达病毒或细菌卵白，刺激机体爆发免疫� ；ば钥固�，或者表达肿瘤新生抗原，从而制备个性化肿瘤疫苗。部分mRNA疫苗如针对基因突变爆发的肿瘤新生抗原开发的疫苗，可以被以为是基因治疗产品。但另一部分mRNA疫苗表达病毒抗原如新冠疫苗可直接表达SARS-CoV-2的刺突卵白或刺突卵白的RBD结构域，诱导机体爆发免疫应答，一样平常不以为是基因治疗产品，故如前所述只是部分mRNA产品属于基因治疗领域。
mRNA疫苗临床前PK/PD考察剖析的要素主要有：
（1）预防用生物制品的指导原则中指出疫苗通常不需要举行通例的药代动力学研究，但某些特殊类型疫苗应需要举行生物漫衍的研究 ；
（2）非临床研究中，需要研究mRNA和脂质纳米颗粒（LNPs）或其它脂质因素是否在接种疫苗的组织中漫衍，它们漫衍在哪些组织中，以及它们的一连时间。
（3）作为疫苗一样平常不必剖析表达产品，但其表达产品的免疫原性相当于其主要的药效指标。
基于mRNA疫苗的机制和效果，关于免疫原性方面，既要思量连系抗体又要思量中和抗体，不但思量B细胞免疫还要思量细胞免疫（拜见图4），与治疗性药物相比，mRNA疫苗的免疫原性很强，一样平常不需要使用高本钱高迅速的检测手艺举行连系抗体的检测。
图4. mRNA疫苗作用机制示意图
mRNA治疗性药物有如下效用方法：
（1）抗体效用，即直接表达用于治疗目今和新发疾病的预防性或治疗性抗体 ；
（2）卵白替换疗法，即直接表达一种人类卵白来解决遗传疾病，如血友�� ；
（3）基因编辑/碱基编辑，即表达基因组编辑卵白或碱基编辑卵白来修饰人类基因表达。
mRNA治疗性药物通过编码功效性治疗卵白，由所表达的卵白产品施展治疗作用。该类药物的临床前PK/PD剖析需要有以下两个思量点：
（1）PD的一连与mRNA产品的表达量和表达时相相关，即保存一定的量效关系 ；
（2）药物的PK研究如吸收和漫衍的研究有利于评价量效关系。
mRNA治疗性药物的临床前PK/PD剖析需要考察的要素有：
（1）PK剖析：即mRNA浓度随时间转变的剖析 ；
（2）将表达产品，即目的卵白的表达量与漫衍作为PD指标举行剖析 ；
（3）脂质体因素的药代漫衍剖析，尤其是新型脂质辅料。
别的，PK/PD与免疫原性间通常具有关联性，关于mRNA治疗性药物需要同时剖析mRNA自己和脂质体因素的免疫原性影响，聚乙二醇化LNP爆发抗体已有报道，抗PEG抗体已被普遍研究和报道，笔者所在机构也剖析出LNP的PEG因素可见一定水平的免疫原性，笔者所在机构表达IgG1亚型抗体的治疗性mRNA产品在食蟹猴静脉给药的PK/PD试验例中周全兼顾了本文所列要点。
图5. mRNA治疗性药物的PK/PD研究设计实验例
现在寡核苷酸类产品成药上市的主要为反义寡核苷酸（ASO）与siRNA，而miRNA研发进入临床试验的少少，以是本部分的剖析仅以ASO与siRNA药物为代表。ASO和siRNA的主要区别在于，前者是单链，后者是双链RNA。而双链的siRNA作用机制与RISC形成有关，RISC可重复作用靶标mRNA ； siRNA被释放的正义链或被降解，也可作为引物，在RNA依赖的RNA聚合酶的催化下以靶mRNA为模板扩增获得dsRNA，dsRNA又可被Dicer降解成siRNA，进入RNAi循环，以是药物效果更长期甚至有级联放大效果。
寡核苷酸类药物的PK特征包括：
（1）静脉给药和其它途径给药，药物进入靶部位的方法差别，导致体内的PK历程也纷歧样 ；
（2）裸siRNA不稳固，易被血液和组织中核酸酶降解 ；
（3）容易在肝脏和肾脏中群集，并经肾脏渗透 ；
（4）非脑内给药时，不易过脑 ；
（5）两条链被修饰的方法纷歧样，导致两条链的PK参数好比峰浓度和袒露量纷歧致 ；
（6）在给药局部存留时间长 ；
（7）血液扫除速率要快于组织 ；
（8）现在的药物基本都为体外合成的RNA分子，可被免疫系统吞噬，有些还会激活自然免疫，如toll样受体加入引发免疫反应，好比滋扰素（IFN-α、IFN-β)、细胞因子（TNF-α、IL-6）爆发等。寡核苷酸药物主要经核酸内或外切酶代谢为短核苷酸碎片，和卵白类药物被卵白酶切割降解为氨基酸类似，以是寡核苷酸药物与古板大分子药物的代谢上有类似之处，但许多寡核苷酸现实又多见修饰，其代谢产品剖析仍需周全思量 ；另其分子量是远大于小分子和一些多肽，分子量较大，需要思量免疫原性潜在的对其PK/PD特征的影响。
寡核苷酸类药物PK/PD考察剖析的战略要点主要包括：
（1）凭证小分子药物PK研究思绪设计相关研究内容 ；
（2）兼顾其大分子药物的部分特征，思量免疫原性的影响，如抗药物抗体（ADA）的剖析，思量代谢扫除缓慢的特点 ；
（3）关于siRNA，剖析反义链和有义链所表征的PK行为是否有差别 ；
（4）须要时，注重考察制剂辅料的PK特点 ；
（5）设置响应PD指标，如新功效卵白的水平转变;
（6）适当设置细胞因子、补体等PD生物标记物指标，针对辅料如PEG的抗体检测;
（7）使用合适平台手艺开发知足现实迅速度需求且稳固的PK生物剖析要领是一大挑战。
剖析寡核苷酸类药物的PK/PD，离不开对其免疫原性的察。由于寡核苷酸类药物是外源性核酸分子，分子量偏大，并且是潜在的弱抗原或半抗原。而免疫原性爆发的主要缘故原由可能与其产品因素、产品的药理学因素以及给药工具因素有关，药理学因素以及给药工具因素详细机制与其它大分子的这两方面因素大致相同，重点要思量该类产品潜在引起免疫原性的自己的产品因素的差别如链型、碱基序列、碱基修饰、递送载体因素、骨架修饰等。免疫原性的考察点的思量基于siRNA等寡核苷酸的外源性性子，宿主系统会将其视为病原体，免疫系统可以通详尽胞外和细胞内差别的病原相关分子模式（PAMP）受体识别单链和双链RNA与toll样受体（TLRs）相互作用爆发免疫应答 ；以及TLRs刺激炎症细胞因子和I型滋扰素（IFN）的过量爆发的免疫反应。既要思量体液免疫剖析，又要思量除寡核苷酸自己外的载体因素，甚至药效机制施展而天生的新的功效性卵白因素的免疫原性。
核酸类药物尤其是寡核苷酸类药物，对生物剖析带来了重大的挑战。寡核苷酸类药物的分子量不大不小、并保存药物不稳固、链型、修饰、弱免疫原或半抗原（导致特异阳性抗体的制备保存现实难题）等特征，这些都是组成其剖析挑战的几大因素。
现在主要有5种主流手艺可以举行核酸类药物的PK剖析，包括PCR手艺、H-LBA、b-DNA、基于杂交的LC-UV/PL以及LC-MS/MS和LC-HRMS（图6）。
其中，qPCR手艺可以利便地检测长度较长的核酸类药物，迅速度高，检测规模宽，可是需要重大的样品处置惩罚历程 ；ddPCR迅速度更高，但耗材用度高，本钱高 ；关于较短的核酸检测来说，虽然也可以通过茎环qPCR（Stem-Loop qPCR）的设计实现，实验相关于较大的核酸要重大。H-LBA要领的特异性高，迅速度好，可是检测效果很是依赖于探针的可靠性和设计技巧及反应历程细节的优化 ；b-DNA要领着实是H-LBA手艺的拓展版，有很高的特异性、准确性和更高的迅速度，但检测效果同样高度依赖于特殊的探针设计及杂交反应手艺细节 ；基于杂交的LC-UV/FL要领可以测定较长核酸类药物，具备较好的特异性和准确性，可是样品处置惩罚重大，迅速度对荧光探针的准确性高度依赖 ；LC-MS/MS和LC-HRMS要领也可以用于核酸类药物的剖析，选择性好，可以区分全长和代谢产品，可是对非修饰的寡核苷酸类药物检测迅速度和特异性相对较差，并且价钱腾贵，不相宜测过长的核酸分子。其它的活体荧光成像，同位素示踪、原位杂交、荧光原位杂交中剖析手艺可以作为增补手段，应用于差别的目的和研究阶段，但它们的精准度差，不大适相助为后续的验证用要领。
图6. 核酸类药物生物剖析的主流手艺比照
近年来，核酸类药物是近几年来最热门一大新药研究偏向。但核酸类药物尤其是寡核苷酸类药物与古板小分子与大分子药物因素保存显著区别，给核酸类药物的生物剖析和PK/PD考察带来了较大的手艺挑战。mRNA药物作为疫苗和治疗性药物时思量点差别，寡核苷酸类药物同时兼顾了巨细分子的一些PK/PD特征，需要凭证详细的分子特征选择PK/PD考察评预战略和剖析的手艺应用战略。
[1]. Sun, H., et al., mRNA-Based Therapeutics in Cancer Treatment. Pharmaceutics, 2023. 15(2).
[2]. Takakusa, H., et al., Drug Metabolism and Pharmacokinetics of Antisense Oligonucleotide Therapeutics: Typical Profiles, Evaluation Approaches, and Points to Consider Compared with Small Molecule Drugs. Nucleic Acid Therapeutics, 2023.
[3]. Munter, R., et al., Studying how administration route and dose regulates antibody generation against LNPs for mRNA delivery with single-particle resolution. Mol Ther Methods Clin Dev, 2023. 29: p. 450-459.
[4]. Mu, R., et al., Bioanalytical Methods and Strategic Perspectives Addressing the Rising Complexity of Novel Bioconjugates and Delivery Routes for Biotherapeutics. BioDrugs, 2022. 36(2): p. 181-196.
[5]. Nonclinical Testing of Individualized Antisense Oligonucleotide Drug Products for Severely Debilitating or Life-Threatening Diseases; Draft Guidance for Sponsor-Investigators; Availability. 2021, Federal Information & News Dispatch, LLC: Washington. p. 22213.
[6]. Krienke, C., et al., A noninflammatory mRNA vaccine for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Science, 2021. 371(6525): p. 145-153.
[7]. Bioanalytical Methods and Strategic Perspectives Addressing the Rising Complexity of Novel Bioconjugates and Delivery Routes for Biotherapeutics.
[8]. Hirabayashi, Y., et al., Considerations of the Japanese Research Working Group for the ICH S6 & Related Issues Regarding Nonclinical Safety Assessments of Oligonucleotide Therapeutics: Comparison with Those of Biopharmaceuticals. Nucleic Acid Therapeutics, 2021. 31(2): p. 114-125.
[9]. 预防用生物制品临床前清静性评价手艺审评一样平常原则.NMPA, 2005.
[10]. 治疗用生物制品非临床清静性评价指导原则.NMPA, 2007.
[11]. 彭双清，郝卫东. 药物清静性评价要害手艺[M]. 北京: 军事医学科学出书社, 2013.
[12]. Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations. WHO, 2021.
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