尊龙凯时荧光原位杂交手艺

2016-04-27

会见量：

荧光原位杂交可用来检测细胞内特定的DNA或RNA，从而判断特定基因的表达和定位，也可用来检测肿瘤或其他疾病爆发或举行中的染色体的改变。

荧光原位杂交

FISH（Fluoresence In Situ Hybridization）手艺是80年月最先生长起来的一种新的定位手艺。在人类基因组研究中获得了普遍的应用．通过中期染色体的FISH可以举行SCP，Cosmid和YAC的染色体定位，嵌合克隆的判别，通过间期核的FISH可以在50kb的区分率下举行基因作图，最新的研究希望已可以举行舒展的染色质丝(chromatin fibre)的FISH，直接丈量基因的长度、从而抵达高精度基因作图的目的。随着FISH手艺生长，它将在人类以及其它物种基因组研究中施展更大的作用。

荧光标记的染色体原位杂交手艺提供了一种快速而有用的手段，将DNA片断和特定的真核生物细胞的染色体区带联系了起来，并将这些DNA片断排序，这是研究DNA顺序在染色体上位置的最直接的要领。

探针标记时可接纳两种基本方法：

（1）直接标记法：将荧光分子直接标记于探针DNA／RNA上，杂交后可直接在荧鲜明微镜下检测。这种方法快速简捷，由于杂交信号较弱、且不可进一步放大，以前这种要领用得未几，但它有配景少的优点，迩来在一些公司的试剂盒中获得应用。

（2）间接标记法：常用的间接法是将一些类似于半抗原(hapten)的标记分子掺入探针分子中。用的较多的试剂有生物素，地谷新(digoxigenin)，二硝基苯(dinitrophenyl，DNP)，氨基乙酰茐(aminoacetylfuorene，AAF)，汞和磺酸盐(sulfonate)。就掺入方法来说，生物素，地谷新等是以核苷酸衍生物的形式掺入的，可用切口平移法来举行。现在更多的人最先用随机引物法。用这两种要领标记好的探针巨细在200一500bp规模内，是用于杂交的最佳巨细。另外，也可以在已知顺序的两个引物之间用PCR法来扩增，或从合适的载体上通过RNA转录而来。

1、原理

FISH手艺是一种主要的非放射性原位杂交手艺。它的基来源理是:使用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记或以非放射性物质标记后与靶DNA举行杂交，再通过免疫细胞化学历程毗连上荧光素标记物，最后在荧鲜明微镜下视察杂交信号，从而对标本待测核酸举行定量、定性及定位剖析。

2、实验流程

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FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧鲜明微镜检测→效果剖析。

3、特点

原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延伸曝光时间增强信号强度，故较迅速。弱点是探针不稳固、自显影时间长、放射线的散射使得空间区分率不高、及同位素操作较繁琐等。接纳荧光标记系统则可战胜这些缺乏，这就是FISH手艺。FISH手艺作为非放射性检测系统，具有以下优点:

首先，从探针的制备杂交来看，生物素和其他标记分子没有放射性，标记历程和杂交历程没有污染的危险，较量清静。并且用生物素或其他的标记分子标记好以后的探针分子相当稳固，没有半衰期的限制，可以恒久生涯。荧鲜明色时间短，不象同位素杂交那样要求长时间曝光，配景简朴。迅速度也绝不逊色。

另外，FISH可以用多种颜色同时显色，这是同位素杂交不可相比的。这种多色作图，可以便染色体分带和探针信号显差别的颜色而同时视察；也可以用差别荧光标记差别的探针，以确定探针在染色体上酌相对位置。

弱点：不可抵达100%杂交，特殊是在应用较短的cDNA探针时效率显着下降。

4、应用

该手艺不但可用于已知基因或序列的染色体定位，并且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。

I．染色体结构变异与非整倍体的检测:荧光原位杂交简化了染色体结构变异的检测。使用原位杂交可较量容易地检测有缺失、附加或替换的染色体。

II．基因扩增和缺失的测:FISH空间区分率和敏感性使得亲本和扩增基因在抗病虫害细胞中定位成为可能。同时用FISH可定位转基因植物中外源基因位置和拷贝数,此法在番茄、烟草、大麦、小麦、黑麦等作物中已获乐成。使用 FISH 手艺也可检测一些与遗传性疾病相关的基因缺失 ,如乐成检测了 aniridia 疾病(一种虹膜缺失的有数遗传异常疾病)患者的缺失基因。

III．FISH 手艺为着丝粒结构研究提供了主要手段。同时应用 FISH 手艺可直接视察染色体端粒 ,这简化了染色体在核内的结构和功效研究。

IV．基因作图:用 FISH 手艺可直接检测 DNA 在染色体上的位置 ,所确定位置是基因在染色体上现实的物理位置。由于原位杂交不受位点内变异和位点间拷贝数的影响,FISH 手艺已成为重复序列和多基因家族作图的主要手段。

V．染色体RNA和基因组进化研究:染色体的主要因素包括DNA和组卵白,除此之外，尚有非组卵白和RNA。对这些物质在染色体中漫衍举行准确定位是研究染色体高级结构和构建染色体模子的要害所在。FISH 手艺为上述研究提供了有用手段。

荧光原位杂交手艺主要应用于以下领域：

细胞的转录谱剖析
·体内外 RNAi 转达和基因敲除
·生物标记物研究
·报告基因筛选
·分子病理学
·干细胞分解
·细胞生物学
·神经生物学

随着标记手段、检测试剂以及荧光视察等手艺的生长，染色体FISH的应用规模在一直拓宽，激光共执聚焦显微手艺的生长，使得核的三维重修可以在盘算机的辅助下得以实现。染色体FISH不但可用来定位基因，并且可用以研究基因在间核中的位置。

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