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11月29日，尊龙凯时临床前毒理研究部副总裁曾宪成博士在基因治疗系列果真课【第4期】中做了主题为《对基因治疗产品非临床研究战略的思索》的报告，本文凭证专家报告内容整理，并经专家审核确认。
曾宪成博士，尊龙凯时临床前毒理研究部副总裁
高级工程师，2010年在上海医药工业研究院获得医学博士学位，2010-2013年在国家上海新药清静评价研究中心事情，在此时代被派往国家食物药品监视治理总局药品审评中心举行新药审评理论和手艺培训和实践 ；2013年加入尊龙凯时普亚医药科技（上海）有限公司，现任毒理研究部副总裁，从事生物手艺药物、疫苗及化学药品一样平常毒性试验研究并肩负毒理研究部团队治理事情。作为项目认真人完成了20个1类化药、8个抗体偶联药物、10个单克隆抗体、2个激素药物、2个预防用疫苗及1个复方药物申报中国和/或美国整套的一样平常毒性和药代动力学研究。作为课题认真人肩负了上海市科委资助的实验动物专项研究2项，作为子课题认真人加入了“十一五”国家新药创造重大专项研究。
若凭证药物结构分类，部分GT产品着实也属于核酸药物，好比使用非病毒载体递送的GT产品。核酸药物由于它自己奇异的物理化学和药理学特点，属于新的临床治疗药物种类，为人类提供了药物研究的新领域。
小分子药物，卵白药物或抗体药物是目今主要的临床治疗药物类型，靶点主要是卵白质，好比酶类，受体，离子通道，转运体和激酶等。但寻找一个新的靶点，并开发成药物仍然是难题重重。
在有数病领域，通例药物难以施展作用，但或允许以依赖GT产品解决。核酸药物现在主要的应用领域是在单基因滋扰，并且较量多的有数病属于单基因异常，NIH报告现在有7000种有数病，其中约80%是单基因异常，半数病例为儿童，而95%尚无治疗手段 ；关于多基因异常的疾病，核酸药物是不是能施展一定的作用尚待研究。
目今核酸药物治疗分为三个主要偏向：增补基因突变失去的功效（如导入正� ；虻牧品ǎ� ；抑制或默然异� ；颍ㄈ鏡NA滋扰疗法） ；直接纠正异� ；蚪峁梗ㄈ缁虮嗉品ǎ�。
基因治疗产品一样平常通过将外源基因（或基因编辑工具）导入靶细胞或组织，替换、赔偿、阻断、修正、增添或敲除特定基因以施展治疗作用。凭证基因导入人体的方法差别，基因治疗可分为体内（in vivo）基因导入和体外（ex vivo）基因导入两种方法。
体内基因治疗产品将外源基因（或基因编辑工具）通过适当的载体直接导入人体施展治疗作用，而体外基因治疗产品一样平常在体外将外源基因（或基因编辑工具）导入细胞，制备成为经基因修饰的细胞或细胞衍生产品，最终经回输以施展治疗作用。（NMPA，《体内基因治疗产品药学研究与评价手艺指导原则》（试行），2022.05）
图1 四种经典/常见基因治疗战略
对GT产品来讲，递送系统是它研究的一个主要方面，到现在为止还没有一个很是理想的递送系统。现在GT产品常用的递送系统可以分为病毒和非病毒载系一切。病毒载系一切现在用的较量多的有逆转录病毒，慢病毒，腺病毒（免疫原性较强）和腺相关病毒等。非病毒载体主要有脂质纳米粒等。
病毒和非病毒载体进入细胞方法、特点及厥后续运气决议了组织漫衍必会成为这类药物研究的重点。另外一方面，应该选择什么动物种属？两种载体进入细胞的方法，转基因从内吞小体的释放，入细胞核方法，后续的转录及翻译历程等都是试验动物种属相关性思量的重点。另外还要思量相关种属剖解结构（好比大脑和脊髓剖解结构、组织尺寸巨细及功效方面 ；大动物，如猴和猪，比大鼠更靠近人，尤其是病毒载体，由于病毒撒播一个主要途径是通过神经。）
相关动物种属的选择还应该思量以下方面：药效靶器官被有用转导 ；载体清静性已知 ；转基因表达水平与人体可比性 ；该种属动物可以泛起该疾病状态 ；动物对基因修饰细胞及转基因表达产品的生物学反应与预期的人体反应的相似性 ；动物对异种泉源的基因修饰细胞的免疫耐受性 ；动物病理心理学特征与拟用患者人群的相似性 ；临床拟用递送/给药方法的可行性。
图2 目今常用病毒/非病毒载体特点较量
正由于病毒载体，尤其是逆转录，有整合到基因组的危害，以是使用病毒载体，尤其是逆转录病毒载体的GT产品通常要评估致癌性。以是关于基因修饰细胞产品来说，致癌性的评估在指导原则中又被放到很是醒目的位置。
2021年《基因治疗产品非临床研究与评价手艺指导原则（试行）》中对致癌性的评估要求有以下几点：标准的啮齿类动物致癌性试验一样平常不适于评价基因治疗产品�？山幽芍ぞ萑ㄖ兀╓eight of Evident, WoE）要领来评估致癌危害，须要时举行致癌性研究。WoE关注因素一样平常包括但不限于：药物靶点和药理作用通路与致癌性相关（例如导入基因产品是生长因子） ；靶点和信号通路的药理作用特征展望与肿瘤爆发生长有一定相关性。插入突变研究的相关效果提醒有致癌危害。载体设计中有潜在致癌危害 ；生产系统中保存引入致癌因素。一样平常毒理学试验组织病理学发明，包括弥漫性和/或局灶性细胞增生、一连的组织损伤和/或慢性炎症，癌前病变和肿瘤爆发 ；激素杂乱。免疫抑制等。现在对基因修饰的细胞产品，除要举行上述致癌性评估外，还需要举行成瘤性评价。
以病毒为载体的基因治疗产品在体内的爆发历程如图3。AAV的细胞外貌黏附由初级糖链受体介导，并由卵白质类次级受体稳固。然后以AAV为基础的载体在通往细胞核的历程中使用多种内吞途径。随后RAAV衣壳在分选室(内小体和高尔基体)中履历了实质性的构象转变。在逃离分选室后，载体粒子群集在核周空间，并通过核孔复合体进入细胞核。在细胞核内，载体基因组被释放和转录，实现转基因的表达。
图3 以AAV病毒载体为例
经典的基因治疗产品体内历程
如图4显示的是GT产品举行非临床评价项目一样平常战略。药理学研究方面需要做动物模子有用性研究，看法验证及清静药理 ；药代动力学的研究则要重点研究袒露量，生物漫衍及脱落研究 ；毒理学方面要做一样平常毒理学，免疫原性，免疫毒性，遗传生殖毒性，致癌性，局部耐受性和病毒脱落危害（尤其是复制型病毒）研究。
图4 基因治疗产品要举行的非临床评价项目
除此之外，2017年欧盟、美国、日本等三个政府或经济联合体在Yale Journal of Biology and Medicine上揭晓文章推荐基因治疗产品非临床清静研究要关注以下问题：制剂组分引起的毒性（好比脂质体差别组分及其它污染物，轻则爆发免疫原性重则会致癌），给药途径引起的毒性（局部用药照旧系统用药），非靶细胞/组织异常漫衍（脱靶问题），载体及转基因一连表达及其表达水平（直接决议了实验动物数据的价值），非靶细胞/组织病毒复制水平，免疫激活和抑制，针对载体的免疫反应，靶细胞活化状态/表型，潜在的插入突变/致癌，潜在的生殖器官撒播，潜在的由患者向家庭成员及照料者的水平撒播（如脱落）等。
GT产品的病毒/非病毒载体递送的是核酸。在机体漫长的进化历程中衍生了一系列识别外来物质的系统或通路，如模式识别受体。当核酸被模式识别受体识别后先会引起先天性免疫反应，这也正是我们要关注的基因治疗产品给药之后引起的早期/急性毒性反应。无论病毒照旧非病毒载体，由于递送内容化学结构很是相似，会共用相同识别系统，最后爆发相似的生物学效应，如爆发I型滋扰素，II型滋扰素，细胞因子等。同时为后期激活顺应性免疫做铺垫。后期爆发的顺应性免疫主要分为细胞免疫和体液免疫，体液免疫是针对病毒的衣壳，或病毒衣壳被降解之后的产品，或转基因表达产品等外来物质爆发响应的抗体。若是是细胞治疗产品，自己就会引起细胞免疫反应。病毒载体免疫原性泉源剖析如图5。
图5 病毒载体免疫原性泉源剖析
在做非临床毒性研究时要重点关注先天性免疫和顺应性免疫反应，常用ELISA，qPCR，ELISpot等要领监测，有时间需要对爆发的抗体举行中和抗体属性判断时间会接纳一些滋扰活性潜能研究的要领。
当我们获悉了免疫原性泉源之后将会增添对指导原则响应条款及要求的明确。指导原则中提到：基因治疗产品可能导致的免疫反应包括先天性免疫和顺应性免疫反应。多种因素可显著影响基因治疗产品的先天性和顺应性免疫反应，如宿主因素（前期接触过相关病毒血清型和/或导入基因产品，免疫系统状态）、基因递送方法（递送系统种类、给药途径和靶组织）、载体（载体种类、血清型、剂量和导入基因的调控原件类型等）、导入基因的产品、异位表达基因产品（特殊是针对免疫宽免器官和/或部位特异性表达的基因产品）� ；蛑瘟撇返拿庖咴钥赡苋从诓分械姆侨嗽椿榉帧⒌既牖虻谋泶锊贰⒃靥濉⒒虮嗉⒌姆窃て诘碾�/卵白质等。病毒载体类基因治疗产品相对更容易爆发免疫原性。别的，还应思量实验动物预存免疫对试验的影响。
既然免疫原性不可阻止，可以做一些消除免疫原性影响的事情。常见战略是使用药物干预而实现免疫抑制。现在研究文献中也有提到其他方法，如通过控制剂量并使用肝脏奇异的不活跃的免疫情形，或使用AAV-CAR Tregs来控制病毒载体的免疫原性。(Frontiers Immunology,2020:11;Molecular Therapy: Methods & Clinical Development,2021:23)。除上述提到的控制免疫原性的战略之外，尚有诸多其他差别的方法。这主要是提醒我们，要关注到预存抗体对实验效果的影响，若是研究这类产品，没有做预存抗体筛选，注定实验效果大都情形下会失败或无申报价值。
病毒载体组织漫衍及倾轧/脱落（shedding）研究重点要关注大脑，两大撒播途径，即血液和神经等 ；除此之外还要关注在生殖系统有没有漫衍。相识上述内容之后，关于指导原则对生物漫衍（含倾轧/脱落）研究的划定就更容易明确了。在生殖毒性研究方面，基因治疗产品应凭证受试者的产品类型、作用机制、一样平常毒剃头现、生物漫衍特征以及患者人群来评估潜在的生殖/发育毒性危害。若是基因治疗产品拟用于有生育可能或妊娠人群，应研究产品对胎儿的影响（例如细胞因子局部天生后通过胎盘转运），开展胚胎-胎仔发育和围产期毒性试验。若是在一样平常毒理学试验中发明有潜在的生殖器官毒性反应，应开展生育力和早期胚胎发育毒性试验。当基因治疗产品在生殖器官一连保存时，需要进一步确定其在生殖细胞（例如卵母细胞、精子）的袒露珠平。
目今GT治疗产品在以下几个方面保存挑战：
1. 在实验研究设计/安排方面，长周期的毒性研究（如6个月毒性试验）是否总是需要 ；选择毒性试验剂量的最好要领 ；若有免疫原性，举行毒性研究的最好方法 ；生物漫衍研究需要收罗几多组织 ；若是接纳相同的病毒衣壳及增强子或相同的脂质纳米粒递送系统，但转基因差别，是否仍需要举行生物漫衍研究 ；若是已有文献数据证实低危害，关于低/不整合的载体是否仍有须要举行整合性研究 ；
2. 研究数据剖析方面，动物体生物漫衍/表达/不良反应怎样外推至人 ；历史数据缺乏 ；
3. 差别要领间、统一家公司差别场合间、公司和外包生产商间、外包生产商批次间等产品间质量一致性方面，什么样的体外比对研究已经可以充辩白明可比性 ；多大的产品差别会导致特殊毒性研究 ；何时及需要哪些研究以研究清晰差别的影响 ；
4. 后期开发方面，需要哪些研究以支持有妊娠需求妇女用药 ；
5. 羁系方面，某些方面在差别羁系机构间尚未告竣一致 ；晚期开发怎样举行缺乏清晰的指导原则（如生殖发育毒性试验及致癌性试验战略）（Molecular Therapy: Methods & Clinical Development,2020 ）。
12月20日20:00-21:30
基因治疗果真课（第5期）将最先直播
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