编者小序
ELISA这项经典手艺已拥有多年的生长历史 ，有多种要领类型 ，竞争性ELISA手艺就是其中一个基本类型 ，它同夹心ELISA法手艺一样 ，也被应用到药物PK剖析研究中；怎样基于竞争性ELISA原理构建好一个竞争性 Assay并在要领建设实践中掌握好相关要点 ，对整个要领的最终乐成尤为主要。作者连系自身实践体会与案例以此文略作叙述 ，供各人参考。
ELISA手艺自从上世纪70年月提出以来 ，经由几十年的生长 ，业已成为生物医药研发领域不可或缺的经典手艺。ELISA要领有州差别类型的分类形式 ，基于反应原理和模式可主要分为直接法、间接法、夹心法及竞争法 ，其它基于差别的分子标记形式、载体形式、捕获形式或信号爆发形式等等的要领如荧光法、化学发光法、电化学发光法、类芯片法、微球法都是这4种基本要领的组合或衍生。
其中 ，夹心法在大分子药物如抗体、卵白药物的PK剖析领域里获得了普遍应用。而关于小分子化合物或分子量偏小的多肽药物 ，除了LC-MS/MS可举行它们的PK剖析外 ，竞争性ELISA要领也可以施展其特有的应用价值和优势。不但云云 ，纵然是分子量较大的卵白及抗体在实践中也仍然可以思量接纳竞争性ELISA法举行相关的PK剖析。因此 ，从可被应用的药物分子类型广度看 ，竞争法是在药物PK剖析领域中最具使用潜能的一种ELISA要领。
迄今数目繁多的现代药物中 ，小分子药物占有着绝大大都 ，许多小分子化合物是不具免疫原性但具免疫反应性的半抗原 ，如常与大分子抗体偶联的作为ADC的Payload的细胞毒素 ，部分激素等。
多肽也是现代药物中举足轻重的一部分 ，例如常见部分激素药物为多肽 ，另如肿瘤新生抗原肽近年还成为药物开发的一个热门。多肽分子量相关于化合物而言较量大 ，相关于抗体、重组卵白或融合卵白 ，其分子量则又很小 ，往往缺乏较为重大的二级结构或空间结构等 ，免疫原性较弱 ，是类半抗原物质。这些半抗原或类半抗原分子在理论上自身单独不可或难以刺激机体爆发抗体 ，但在偶联了载体抗原分子后再免疫动物可以制备出与该分子自己举行连系反应的抗体 ，从而为构建对其举行ELISA测定的要领提供工具性试剂。
这些半抗原分子很小 ，往往着实仅有一个表位 ，不可形成差别位点与抗体连系的夹心之式；纵然有的类半抗原多肽可能会保存两个或以上的表位 ，但抗体制备中的现实是常很难获得针对差别表位可以组成夹心配对使用的抗体 ，此种情形下 ，选择构建竞争性ELISA方规则是一个因材施措的战略。有些分子量足较大、足够重大的含有多个表位的具完全抗原性的分子 ，如在仅一株单抗或仅有其多抗可被使用的现实条件下 ，也需思量选择设计竞争性的检测要领；虽然 ，关于具备条件接纳夹心法检测的完全免抗原性抗体或卵白分子 ，有的情形下相关研究职员仍思量使用竞争性ELISA要领举行测定也不是未尝不可。
怎样基于自己可使用的抗体试剂现真相形、所在实验室详细的平台条件 ，综合评估目的研究的试验设计 ，基于竞争性ELISA原理乐成建设一个 “Fit-for-Purpose”的剖析要领 ，也是临床前和临床PK或PK/PD评价研究中一个详细又现实的手艺性问题。
竞争性ELISA原理用于药物PK定量剖析的要领学设计战略
用于定量剖析药物PK浓度的竞争性ELISA要领通常有两种基本的Assay构建模式：
一种模式是以单抗或多抗作为固相捕获试剂 ，样品中游离（本文中游离特指非固相化）药物与标记药物竞争连系固相的抗体 ，如游离药物和生物素标记的药物竞争性连系包被在板孔的抗体（拜见图1）。
另一种模式就是将一定浓度的药物包被在固相载体上 ，接纳样品中游离药物与固相药物竞争性连系游离的抗体（若图2）。
这两种Assay模式在抗体药PK剖析的应用上也可以转化为游离药物与标记药物竞争它们固相的靶点分子 ，或游离药物与固相药物竞争性连系标记的靶点分子；关于有的药物也还可以转化为对其受体分子的竞争性连系。详细设计时可以基于此两种Assay模式举行衍生或转化。
图1 游离药物与标记药物竞争的Assay模式
图2 游离药物与固相药物竞争的Assay模式
基于药物与标记药物竞争的这一模式 ，药物分子可以用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）直接标记 ，这样的标记的药物主要用于对迅速度要求不高且基于古板可见光吸收法检测平台的竞争性Assay开发�；诠虐骞馕占觳馄教ㄒ部梢越幽缮锼乇昙� ，借助链霉亲和素-生物素信号放大系统举行较高迅速度Assay的构建。随着分子标记手艺的生长和新平台的一直泛起 ，如若需要开发更为迅速的竞争性Assay ，也可以接纳荧光素标记药物分子建设荧光检测的要领 ，或可接纳镧系元素中的Eu(铕)标记药物基于时间区分荧光平台举行检测 ，若有MSD平台的剖析实验室还可以使用该公司的SULFO-TAG标记药物分子开发电化学发光的检测要领。接纳标记药物和非标记药物竞争的模式 ，选择什么样的标记分子 ，爆发什么类型的信号 ，可以基于自身实验室平台条件或仪器所拥有的检测功效�？楹拖质敌枰难杆俣燃氨昙堑目尚行郧樾问笛橄晗傅恼铰�。
接纳游离药物与固相药物竞争的模式时 ，一个优势是通�？梢悦馊ゾ傩蟹肿颖昙堑钠独� ，节约了标记本钱 ，特殊是当标记缺乏可行性时 ，若有些药物分子缺乏与标记物相连系的基团或药物分子被标记后其自己的稳固性或其它基团受到了影响的情形下接纳此种竞争法是一种很好的应对战略。然而 ，有时实践中我们会发明药物直接包被在固相载体上限制了其与非固相抗体的有用连系 ，Assay的整体信号禁止易上去 ，迅速度难获得提高等征象 ，可能是固相化后其表位受到了影响。然而 ，将非标记的药物直接固相化刷新为间接固相化 ，这种连系反应被影响的情形有时会获得改善 ，如在标记可行的情形下 ，先将药物举行生物素标记 ，使生物素标记的药物与固相载体上包被的Streptavidin连系间接实现药物固相化再与游离药物竞争（拜见图3）。剖析职员可以自行包被Streptavidin ，也可以购置商业化的包被有Streptavidin质料直接使用 ，如Thermo和MSD等公司均有商业化的Streptavidin Coated Plate提供。
图3 游离药物与间接固相化药物竞争的Assay模式
剖析要领学模式的构建要连系详细实验室的平台条件、可供使用的抗体情形、药物分子的结构与性子、目的研究对迅速度和要领检测规模的适用性要求等因向来制订详细战略。
竞争性ELISA原理应用于药物PK剖析要领学建设的实践性要点
竞争性反应系统的组成
竞争性Assay的一个焦点原理就是“竞争” ，因此实践此类要领建设的焦点要点就是具有竞争性特征的抗原抗体反应系统的组成 ，即是要营造一个能促成“竞争”爆发的ELISA反应系统。上述两种基本的竞争性ELISA Assay Format ，都由三个主要因素组成 ，即：游离药物、标记药物或固相化药物、抗体。这三大主要因素 ，我们可以划分把其看法化为：竞争因子、被竞争因子、资源因子。
这三大因子是组成竞争性情形即反应系统的必需。标记药物或固相化于载体的药物在反应系统中浓度是牢靠的；而样品中游离药物浓度是非牢靠的 ，特殊是PK定量剖析要领中要用到标准曲线 ，被测样品中游离药物与组成标准曲线的差别浓度梯度的游离药物都是要与标记药物或固相化于载体的药物竞争性连系系统中的抗体 ，因此反应系统中抗体可以说是竞争性Assay中的“资源因子”；游离药物与标记药物或固相化于载体的药物互为竞争和被竞争的关系 ，为便于叙述 ，此文中我们把游离药物称为“竞争因子”、标记药物或固相化于载体的药物称为“被竞争因子” ，着实两者互为相互的竞争因子。
营造竞争性反应系统的基础
在微观天下里的一些分子间的相互影响或作用着实与宏观天下甚至人类天下里的征象是具有共通的地方 ，在某种资源有限的情形下 ，人与人世就会爆发对该有限资源的争抢即竞争性地占有资源。同样 ，竞争性Assay反应系统中竞争因子与被竞争因子间的竞争关系爆发基础就是“资源有限” ，关于竞争性ELISA而言就是抗体有限或详细说抗体所含的药物总连系位点有限。若是抗体量过多或所谓饱和 ，则不可造成游离药物与标记药物或固相化药物的竞争 ，这样的竞争性ELISA反应系统则是失灵的。
表1和图4为一个正在建设中的某低分子药物的竞争性ELISA PK Assay案例（案例一） ，凭证给药剂量、方法等展望需要开发一个定量规模在0.391-25ng/mL的剖析要领 ，接纳的是固相药物和游离药物竞争性连系其单克隆抗体的模式。统一批配制泉源的标准曲线 ，当抗体浓度（此处以现实使用时的稀释倍数显示）很是高时（1/500） ，差别浓度的标准品的信号值无梯度性转变和显着差别 ，此情形下 ，抗体浓度过高没有造成游离药物竞争滋扰掉固相药物与抗体的连系而不可使信号呈浓度梯度依赖性的差别转变。其它条件都相同时 ，降低单抗稀释倍数到1:2000 ，标曲高浓度点间差别浓度梯度的标准品的信号值差别最先显着泛起 ，预示竞争爆发；当继续降低单抗稀释倍数至1:5000 ，这种浓度梯度依赖性的信号差别则更为显著 ，标曲拟合趋势向好。
表1：案例一中调理固相化抗体浓度后对要领体现的影响
图4:表1对应的3个差别条件下的标准曲线
竞争因子间的调控
关于一个竞争性ELISA Assay而言 ，除了仅提供有限的“资源因子” ，还需思量到“竞争因子”与“被竞争因子”间的势力巨细问题 ，即互为竞争工具的两者间不可泛起竞争绝对势力方。绝对势力方会因其绝对优势而导致对应的竞争方毫无对其滋扰的能力。关于这一点人类天下的征象和微观天下的征象同样是相通的。如两个势均力敌的人屠杀时可以僵持良久 ，当一小我私家与两小我私家同时屠杀时也可能会坚持一段时间 ，当一小我私家同十几小我私家同时屠杀时由于实力比照悬殊 ，毫无对抗能力可言 ，极易瞬间被对方击溃 ，甚至连出招对抗的时机都没有。竞争性ELISA要领建设时 ，若是作为被竞争因子的固相化药物或标记药物比例或浓度过高 ，则导致作为“竞争因子”的游离药物不会或险些不会对被竞争因子与抗体连系的滋扰 ，标准曲线的差别浓度标准品间的信号梯度不可泛起或不显著 ，标准曲线难以拟合或拟合质量不高而不具备较好的对未知样品的丈量区分力 ，进而影响对现实的样品真实准确定量。因此 ，实践中客服这一问题时要注重加入反应的竞争因子间比例调控。
视察竞争性因子的竞争能力 ，可以通过将样品信号值归一化为连系百分比（B/B0）来视察,则竞争因子滋扰被竞争因子与抗体连系能力更显直观。实践中常见的就是仅在几个高浓度标曲点上泛起了连系百分比的梯度依赖性差别 ，低浓度点的B/B0无显著差别或险些稳固 ，即低浓度标准品不可很好地加入标曲拟合 ，此种情形下一样平常是被竞争性因子相关于低浓度游离药物而言仍占有了绝对优势 ，从而影响了要领的检测迅速度 ，可以实验调低被竞争因子的使用浓度或比例。如表2和图5所示案例二：该要领为一个抗体药物的竞争性ELISA要领 ，Assay Format为游离药物与生物素标记药物竞争其抗奇异型抗体 ，统一批配制泉源的标曲 ，在生物素标记药物稀释比例为1/30000时 ，几个高浓度标曲点上泛起了连系百分比的浓度梯度依赖性差别 ，但低浓度水平的标准品B/B0险些无差别 ，标曲低浓度端趋平缓 ，拟合不睬想 ，其低浓度质控品的准确度也受到影响；当生物素标记药物稀释比例为1/40000时 ，低浓度水平的标准品B/B0差别显著 ，标曲获得了很好拟合 ，来自于统一配制的低浓度质控品的准确度也趋好。
表2：案例二中差别生物素标记药物比例下的要领体现的较量
图5:表2对应的2个差别条件下的标准曲线
平衡性竞争系统与非平衡性竞争系统的应用
在社会生涯中 ，我们经常听说差池等竞争或不公正竞争。竞争性ELISA Assay同样可以有对等的竞争和差池等的竞争 ，此文将其看法化为平衡竞争法和非平衡竞争法。
平衡竞争法中是同步开启“竞争因子”与“被竞争因子”对“资源因子”如抗体的连系反应 ，在标记药物与非标记药物的竞争性Assay Format中 ，将标记药物与非标记药物同步或险些无时差性加入到已包被有抗体的固相载体中实现平衡的竞争；在游离药物与固相药物的竞争性Assay Format中 ，先将含游离药物的样品加入已包被药物的固相载体中 ，再行加入抗体实现平衡的竞争。
反之 ，非平衡竞争法中则是非同步开启“竞争因子”与“被竞争因子”对“资源因子”如抗体的连系反应；在标记药物与非标记药物的竞争性Assay Format中 ，可以先将标记药物或非标记药物加入到已包被有抗体的固相载体中 ，反应一段时间后再加入另一非标记药物或标记药物实现非平衡式竞争；在游离药物与固相药物的竞争性AssayFormat中 ，先将含游离药物的样品与抗体在单独的载体中混淆反应一段时间后 ，再加入到已包被药物的固相载体中 ，或先将抗体加入到已包被药物的固相载体上 ，反应一段时间后 ，再将含游离药物的样品加入其中加入反应实现非平衡式竞争。一样平常来说 ，研究职员习惯于平衡性竞争法的操作流程 ，但有的情形下接纳非平衡的竞争法 ，有利于Assay性能的优化。
如表3和图6中的案例三 ，接纳的是固相抗原和游离抗原竞争性连系抗体的模式定量检测某多肽药物 ，此例中的标曲与QC也泉源于统一批配制。其它条件都相同的条件下 ，当将游离药物与抗体先混淆一起反应一段时间后加入包被有药物的微孔板中 ，则该剖析要领的体现要比先将游离药物加入包被有药物的微孔板中再连忙加入抗体的平衡性竞争方法好许多。非平衡性竞争法中的标曲低浓度点间的B/B0间差别更为显著 ，标准曲线拟合质量更佳 ，QC的准确度可靠 ，而非平衡性竞争中不但标曲低浓度端平缓 ，同样泉源的QC也体现不佳。
表3 案例三中平衡性竞争与非平衡性竞争的较量
图6:表3对应的2个差别条件下的标准曲线
结语
综上所述 ，竞争性ELISA法用于PK定量剖析是相对较难的一种要领 ，详细实践中若要使用好这一要领 ，始终要基于“竞争”这一基础原理睁开反应系统的构建与优化。由于分子间的竞争与相互作用 ，都是肉眼无法看到的微观天下里的行为 ，将宏观天下或说人类天下的征象发散到对微观天下中个体间关系和作用的想象与思索中 ，未免不是一个借鉴性头脑方法。同人类天下相似 ，实践中无论是基于哪种竞争性剖析模式 ，首先要营造好竞争性的情形 ，即提供有限的资源引发竞争；还要增进差别化的“竞争”效果的爆发 ，关于竞争性ELISA要领 ，竞争性因子间无需势均力敌 ，但要避免具有绝对优势的竞争因子泛起。为便于叙述 ，上述内容主要基于古板的竞争ELISA检测模式举行了举例和叙述 ，文中这些实践性的战略和要点可以连系一些新的平台举行衍生和优化使用 ，并也可以拓展到对内源性分子的检测中 ，笔者的实验室都有着种种衍生性的竞争性ELISA要领的详细实践 ，原理相通 ，不再逐一举例。别的 ，作为PK定量的ELISA要领同常用到的其它PK定量法一样 ，要领建设后也需要举行种种后续参数的优化与验证 ，已有许多相关文献叙述 ，因此本文不再赘述 ，掌握好本文提出的战略和要点 ，将会为后续各参数的顺遂优化和验证涤讪一个优异基础。
（未经允许 ，文章内的所有图片和数据不得引用）
作者简介
章登吉 ，本硕博划分就读于安徽师范大学、上海师范大学&中国农业科学院上海兽医所和复旦大学 ，主攻偏向为大分子药物与细胞基因治疗药物的剖析与评价。曾任职上海药明康德大分子生物剖析部多年 ，加入尊龙凯时后建设了生物手艺药物剖析团队 ，现为尊龙凯时普亚生物手艺药物生物剖析部分认真人 ，具有13年多的临床和临床宿世物手艺药物剖析履历 ，认真过Novartis, Pfizer, Lilly, J&J, Genentech, Medimmune, Takeda ，石药集团等多家医药企业的多类型生物药相关剖析评价事情。在生物手艺药的药代动力学、毒代动力学、免疫原性及生物标记物相关的剖析方面有着富厚的理论基础和实践履历 ，撰写相关文章多篇 ，作为第一发明人申请相关国家发明专利五项 ，有三项已经获得授权。
实验室简介
尊龙凯时生物手艺药物的生物剖析实验室拥有SpectraMaxM4/M5/i3x, MSD S600, Luminex, Biacore 8K, Envision, Gyrolab ，Covaris E220R ， ABI7500 qPCR仪等全方位多功效的手艺平台 ，提供周全切合FDA/CFDA GLP ，GCP规范的生物手艺药物生物剖析效劳 ，以支持卵白药物、抗体药物、ADC药物、多肽药物、核酸药物、细胞基因治疗药物的早期筛选与开发 ，及其临床前和临床相关研究。
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