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前言
近年来肿瘤免疫治疗取得显著希望，尤其是基于mRNA手艺的治疗性疫苗，在临床试验中展现出卓越疗效，为肿瘤防治开发新途径 。mRNA疫苗通过特异性抗原呈递有用抑制肿瘤细胞增殖和转移，连系AI辅助展望系统，有望实现真正的个体化疫苗设计，延伸患者无希望生涯期 。以免疫微情形调控为焦点的精准治疗新范式，推动肿瘤治疗从“广谱治疗”向“个体化医疗”转变 。
尊龙凯时基于成熟的手艺平台和履历，一连深耕mRNA肿瘤疫苗研发平台，致力于为客户提供更快速、更合规、更优质的效劳 。
制剂剖析要领
? RT-qPCR
生物剖析要领
? RT-qPCR: mRNA
? ELISA: mRNA表达卵白；mRNA疫苗免疫原性（效价）
? ELISPOT: IFN-γ水平
制剂清静性研究
? 给药部位刺激试验（连系重复给药毒性试验举行或单独开展兔刺激性试验）
? 豚鼠自动过敏试验
? 兔体外溶血试验
组织漫衍试验（大鼠）
制剂剖析要领
? RiboGreen
生物剖析要领
? qPCR: mRNA
? ELISA: mRNA表达卵白
? ELISPOT: IFN-γ水平
? ECL: ADA
大鼠重复给药GLP毒性试验
食蟹猴重复给药GLP毒性试验
制剂清静性研究
? 给药部位刺激试验（连系重复给药毒性试验举行或单独开展兔刺激性试验）
? 豚鼠自动过敏试验
? 兔体外溶血试验
组织漫衍试验（大鼠）
清静药理试验
? SD大鼠FOB, SD大鼠呼吸系统清静药理，猴心血管系统清静药理（陪同）
一样平常来说凭证制备手艺，肿瘤疫苗可分为四类：细胞疫苗、肽类疫苗、病毒疫苗、和核酸疫苗 。核酸疫苗是指含有由DNA或RNA编码的抗原的疫苗 。核酸疫苗是一个远景辽阔且极具吸引力的疫苗平台，由于其可在一次免疫中注射多种抗原，并能够诱导强烈的MHC-I介导的CD8+ T细胞应答 。与古板疫苗相比，核酸疫苗已显示出诸多优势，例如清静性、诱导针对目的抗原的免疫应答的特异性、可同时诱导体液和细胞免疫应答、生产成内情对较低以及易于制造 。
Different types of cancer vaccine platforms[1]
mRNA肿瘤疫苗是一种基于mRNA的免疫疗法，能够编码肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)，通过诱导或增强有用的抗肿瘤免疫反应而起效 。mRNA疫苗被抗原呈递细胞内吞并被转运到细胞质，由核糖体翻译爆发目的抗原卵白，经由多种途径刺激机体免疫反应：
(1) MHC-I呈递途径
? 细胞内抗原卵白被卵白酶体剖析成抗原肽表位，通过I类主要组织相容性复合体 (MHC Class I) 运送到细胞外貌呈递给CD8+ T细胞；活化的CD8+ T细胞具备细胞毒性，可特异性杀伤靶细胞
(2) MHC-II呈递途径
? 渗透的抗原卵白可被细胞内吞并降解，通过MHC-II类卵白运送至细胞外貌呈递给CD4+ T细胞；CD4+ T细胞通过促炎细胞因子激活吞噬细胞，增强其杀伤和吞噬靶细胞的能力，另一方面CD4+ T细胞可以共激活抗原特异性B细胞并诱导体液免疫反应
mRNA-based vaccine mode of action[2]
mRNA肿瘤疫苗具有多种优势，如：
? 抗原选择规模广
? 自佐剂：体现更强的免疫原性
? 清静性：不整合到基因组，清静性高于DNA疫苗
? 生物化学合成，生产历程无病毒熏染危害
? 不依赖于细胞作育，构建速率快，借助于人工智能、盘算生物学、疫苗学等
已有临床前和临床研究证实mRNA疫苗具有抗癌的可行性 。现在正在开发种种mRNA肿瘤疫苗用于种种癌症治疗 。别的，个性化mRNA疫苗为精准癌症治疗开发了新的偏向 。随着个性化肿瘤疫苗研究和临床试验的一直增添，开发针对差别类型肿瘤的mRNA疫苗的可能性日益增添 。
The advantages of mRNA vaccines in the context of cancer therapy[3]
药学研究阶段
? 肿瘤新抗原的识别和筛选
? mRNA核酸序列设计和修饰
? 递送系统优化
临床前研究阶段
? 动物模子选择是焦点和要害
典范的mRNA由一个两侧为5′非翻译区 (UTR) 的帽子、3′ 非翻译区 (UTR)、一个编码mRNA肿瘤疫苗中癌症抗原的开放阅读框 (ORF) 和一个poly(A) 尾组成 。mRNA的这些因素可以通过修饰来提高稳固性、翻译效率和免疫刺激特征 。设计和优化要领包括编码区的设计和优化、非编码区的设计和优化以及递送形式的设计和优化 。
mRNA structural elements[1]
编码肿瘤抗原的mRNA序列：
优化mRNA的翻译和稳固性
? 5‘端加帽（5’Cap)和修饰：常见的如通过噬菌体聚合酶将帽类似物(m7GpppG)添加到mRNA的5‘端，提高mRNA的稳固性和翻译效率；
? 5‘-UTR和3’-UTR修饰：5‘-UTR和3’-UTR包括种种影响mRNA稳固性、翻译和定位的调控序列；
? 开放阅读框架(ORF)中的密码子优化，提高mRNA的稳固性、调控翻译速率和卵白质产量；
? Poly(A) tail修饰：Poly(A) tail是基因表达的主要调理因子，通过与5‘ cap协同作用来调理mRNA的翻译，并加入调理mRNA的稳固性 。
免疫原性的调理
? 体外转录mRNA的纯化、转录条件改变、核苷酸修饰、添加特殊佐剂等 。
疫苗佐剂（可选添加）：
? TLR激动剂：如TLR4激动剂MPLA、TLR7激动剂Imiquimod；
? STING激动剂；
? TriMix（一种编码CD40配体、CD70和TLR4三种卵白的鸡尾酒mRNA）；
? 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；
? 一些mRNA载体，如阳离子脂质和鱼精卵白 。
mRNA疫苗的递送系统:
脂质纳米颗粒(LNP)递送系统
? 现在应用最普遍的mRNA递送递送，主要由可电离的氨基脂质、聚乙二醇、磷脂和胆固醇组成；
? 带负电荷的mRNA分子可以通过与带正电荷的脂质的静电相互作用稳固地运送到包裹在内核中，而不受细胞外RNase和内体的酶降解 。
聚合物载体纳米递送系统
? 多聚体或基于聚合物的核酸载体与LNPs相似，由于多聚体也可以带正电荷，并通过与mRNA的静电相互作用来转染mRNA；
? 常用的聚合物递送系统如聚乙烯亚胺(PEI)、聚l-赖氨酸(PLL)、聚酰胺胺(PAMAM)、聚β-氨基酯(PBAE)、氨基聚酯 。
基于多肽的递送系统
? 某些带正电荷的氨基酸能够通过静电相互作用吸附mRNA，以及细胞穿透肽(CPPs)能够快速内化穿过生物膜；
? 鱼精卵白是一种典范的多肽载体，除了稳固地连系mRNA举行递送外，还可以作为佐剂来激活TLR7/8以诱导先天性免疫反应 。
混淆纳米颗粒递送系统
? mRNA癌症疫苗的递送还可使用多种组分混淆制成的载体，例如脂质、聚合物、肽、外泌体和细胞膜等；
? 脂质/聚合物杂化纳米粒（LPHNs）：一样平常由可电离脂质、疏水聚合物和聚乙二醇脂质组成，可以通过组分和比例优化实现高转染效率；
? 阳离子纳米乳（CNEs）：由脂质和聚合物组成的水包油递送载体 。
病毒载体递送系统
? 如腺病毒、甲病毒、仙台病毒、黄病毒和小核糖核酸病毒被用于mRNA的递送 。
DC细胞递送系统
? DC是早期疫苗研究的主要递送工具，可以通过电穿孔将主要编码抗原的mRNA有用地导入DC细胞 。
裸mRNA
? 直接注射裸mRNA：由于快速降解和细胞摄取较差，递送裸mRNA效率低下 。
原液质控：mRNA判断包括外观、判别、pH值、序列长度、序列完整性及准确性、含量、加帽率、加尾结构或长度和纯度等指标 。
制品质控：制品阶段除通例的疫苗外观、装量、pH值、清静性和效力项目外，质控项目主要针对mRNA判断（判别、含量、纯度、完整性），递送系统各组分判断（判别、含量），制剂特征项目[包封率、纳米颗粒粒径、疏散系数（PDI）、Zeta 电位] 以及工艺相关杂质残留（有机溶剂等）3个部分 。
看法验证测试：mRNA疫苗的临床前开发需验证其活性和机制 。体外实验通过共作育T细胞（来自PBMC或全血）与表达TAA的肿瘤细胞系举行 。关于靶向TSA的个性化疫苗，因TSA的患者特异性，通常接纳多种体外要领，如新抗原的PBMC作育评估，替换商业上难以获取的合成TSA肿瘤细胞系 。
动物模子选择：动物模子对评估mRNA疫苗的清静性和活性至关主要 。通过评估疫苗接种后的抗肿瘤效果、存活率和免疫反应，深入相识作用机制 。评估联合应用mRNA疫苗和检查点抑制剂的效果，支持未来可能的联合治疗 。
模子选择战略：
? 通用型肿瘤疫苗，确认靶点同源性后，使用鼠源模子
? 个性化肿瘤疫苗，使用鼠源肿瘤细胞构建个性化疫苗，用鼠源模子验证
? 有MHC限制性的肿瘤疫苗，使用HLA人源化免疫健全小鼠
? 使用靶点人源化小鼠肿瘤细胞完成看法验证
? 使用HSC免疫系统人源化动物模子举行药效验证
体内看法验证研究：体内看法验证研究旨在确定活性剂量规模和最佳给药计划 。通过在小鼠肿瘤模子中评估抗肿瘤作用、存活率、免疫反应或细胞因子诱导，周全相识mRNA疫苗效果，建设免疫原性模子，为临床试验提供要害信息 。
给药途径：给药途径影响mRNA疫苗的生物漫衍、一连性、活性一连时间和剂量反应 �？乖岢氏赴詍RNA疫苗的摄取、表达和呈递水平因注射途径而异，进而影响疫苗的效力和免疫刺激区域 。
mRNA疫苗的主要给药战略包括：
? 皮下注射
? 皮内注射
? 结节内注射
? 肌肉注射
? 静脉注射
? 肿瘤内注射
? 鞘内注射
Different strategies for the administration of mRNA vaccines[4]
清静性评价：清静性评价是RNA肿瘤疫苗临床前开发的要害环节，接纳严酷的试验设计，并且切合GLP标准，确保试验的科学性以及合规性 。使用适当的动物模子模拟人体心理和免疫反应，评估mRNA疫苗的潜在毒性，重点关注动物的临床体现、体温转变、相关的炎症反应、，尤其关注疫苗的递送系统对肝脏，脾脏等免疫系统或组织的影响，以及对免疫相关指标如淋巴细胞表型、细胞因子、急性反应期卵白水平（α1和α2）等的影响，为后续临床试验提供充分参考 。
mRNA肿瘤疫苗在癌症治疗领域显示出重大的潜力和希望 。随着手艺的一直前进和临床验证的深入，mRNA疫苗已成为一种引人注目的治疗选择 。只管mRNA疫苗在实验室和早期临床阶段显示出希望，但它们仍面临一些挑战，包括稳固性、递送系统和免疫原性的问题 。未来的研究需要解决这些局限性，例如通过优化mRNA序列、刷新递送载体和增强疫苗的稳固性来提高疫苗的效果和清静性 。
mRNA手艺的无邪性和可扩展性使其在未来的癌症治疗中具有辽阔的应用远景 。连系其他治疗要领，如免疫检查点抑制剂，mRNA疫苗可能提供更有用的治疗计划 。别的，随着手艺的进一步生长和深入相识mRNA疫苗的生物学机制，未来可能会有更多立异疫苗问世，为癌症患者提供更多治疗选择 。
尊龙凯时具有领先的mRNA肿瘤疫苗研发效劳平台，可为mRNA肿瘤疫苗的开发提供高效优质的解决计划，为种种新型生物手艺药及疫苗的清静性和有用性评价提供全方位支持！
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