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染色体原位分子杂交手艺
染色体原位分子杂交手艺 二、探针（probes） 1．基因组探针（Genomic probe）：
人类基因组内一些高频率的重复序列，在进化上很少具有守旧性 。若 以基因组DNA作为探针，这些保存于探针和靶细胞顺序中的高度重复序列之间会首先退火连系，越过那些守旧的饿和简单的序列，故杂交会泛起出种特异性 。使用这类探针在人鼠杂交细胞中可特异显示人的遗传物质 。
2．染色体特异性序列探针（Probe recognizing chromosome specific sequences)：
现在在人险些所有染色体中已经克隆出一些重复序列，重复一百到五千次不等，各具染色体特异性 。大多在某一染色体的着丝粒区或异染色质区爆发致密的杂交带 。从而可特异性地识别某一染色体 。
3．染色体文库探针（chromosome labraries probe）：
染色体文库网络人类单条染色体的DNA作为探针，又称整体染色体探针或染色体染探针 。单条染色体的获得一样平常有两种要领：来自仅携有某一条人类染色体的体细胞杂交株，或经流式细胞分类仪从染色体悬液中疏散
4．简单序列探针（single-copy sequences probe）：
FISH有一弱点，就是要求探针足够大，探针越小，杂交位点检出率就越低 。欲使用FISH检测保存基因组内的简单序列基因，最有用的要领是应用含大插入片断的克隆载体，如全Cosmids（载约40kb的插入片断），更大的YAC载体（载100-800kb插入片断） 。若掌握好，小到2kb的质粒探针亦可用FISH要领定位，但效率较低 。
三、FISH手艺系列 1． 24色mFISH核型剖析手艺
24色mFISH是近年建设的一种新手艺 。其原理是使用5种荧光染料按比例标记探针，杂交后形成24条染色体各自泛起特异的荧光色彩以供核型剖析 。为研究职员提供了更富厚详尽的细胞遗传学信息，包括确定标记染色体的泉源、检测细小的染色体易位和检测重大的染色体易位，尤其为肿瘤细胞染色体剖析提供了全新、高效的要领 。
2．原位杂交显带手艺(In situ hybridization banding,ISHB)
为了准确定位原位杂交部位所处染色体及其区带，染色体必需显带 。但无论是先杂交后显带，照旧显带后杂交，杂交与显带历程回相互影响效果 。厥后人们注重到，人类短距离插入重复序列中的一种Alu家族，Alu片
段约300bp长，在基因组中重复约九十万次，平均距离3-4kb就插入一个 。有人使用部分Alu序列作为引物，用PCR要领扩增Alu之间的DNA，称Alu-PCR法 。但Alu序列在基因组内漫衍不是随机的，有些区域较量麋集，有些区域较希罕 。只有前者才有PCR产品 。人们用Alu-PCR产品作为探针与人类染色体标本杂交，效果获得类似R带的荧光带型 。故人们在举行基因定位时，只需将目的探针与Alu-PCR探针同时应用，用差别颜色的荧光标记，就可同时显示杂交信号和染色体带型 。
3．FISH基因定位（FISH mapping）
基因定位时，不但需要确定某段靶序列在染色体上的位置，尚需确定两个或两个以上靶序列在线性DNA分子的排列序次和距离，才华绘出基因图 。一样平常用同位素杂交：先确定每一靶序列在中期染色体上的位置，然后凭证它们到端粒的距离确定出线形排列序次 。而用FISH要领，两种或两种以上的探针能同时与中期染色体杂交，只要凭证两种颜色杂交位点的相互位置，就能直接确定序次 。但中期染色体是线形DNA分子经由折叠和包装后形成的，若两个靶序列相距很近， 例如间距小于1Mbp，受包装历程的影响，它们 在线形DNA分子上的排列与在中期染色体上的排列纷歧定相同，甚至可能完全相反 。学者们发明，靶序列之间在间期核的平均相对距离与它们在线形DNA分子上的距离呈正相关 。使用间期核FISH剖析不但能扫除染色体包装的影响，还能提高测距的区分率 。
四、FISH的应用 1．基因定位与基因制图（Gene mapping）
原理前面已叙述 。FISH已经极大地加速了人类基因定位和基因制图的历程 。
2．基因诊断(Gene diagnosis)
准确、直观、明晰
3．间期细胞遗传学（Interphase cytogenetics）
4．FISH在肿瘤生物学中的应用
（1）肿瘤细胞遗传学（Onco-cytogenetics）
（2）基因定位：FISH可用于疏散出的癌基因与抑癌基因起源定位
（3）病毒基因插入基因组部分的检测：
虽然逆转录病毒以激活原癌基由于主，也有象腺病毒、HPV、SV40等病毒以卵白产品与抑癌基因卵白产品相互作用而诱导细胞转化 。但病毒基因特殊是DNA病毒多有病毒基因因素插入到人基因组 。使用FISH可以检测到病毒整合到人基因组中的情形，对深入研究病毒致癌机理，以及检测、防治均具有主要意义 。
（4）基因的扩增与缺失
原癌基因的激活与抑癌基因的失活是现在肿瘤研究的热门 。
已知原癌基因的激活方法有：突变、基因扩增、易位、病毒序列插入 。
抑癌基因的激活方法有：点突变、基因缺失 。
FISH为研究基因的扩增和缺失提供了新的要领，能将基因扩增和染色体重复脱离 。
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