迄今为止本世纪已经泛起了三种冠状病毒的全球盛行。2002年11月在中国佛山报道了第一例人类熏染严重急性呼吸系统综合症冠状病毒（SARS-CoV）的病例，到2003年7月在全球27个国家中发明了8000多例SARS病例。SARS-CoV熏染的主要症状是流感样，包括发热、头痛、全身乏力、颤抖和腹泻。SARS大盛行十年后，沙特阿拉伯一名男子被诊断出一种新的冠状病毒，即中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV），由于受熏染者的国际旅行，MERS-CoV已遍布全球。从2012年9月到2019年12月尾，总共报告了2502例经实验室确认的MERS-CoV熏染病例，包括858例相关殒命。
在2019年12月，COVID-19爆发，目今的研究批注，这种冠状病毒类似于SARS-CoV。只管这三种冠状病毒被确定对人类具有高致病性，但尚无有用的抗病毒治疗要领。因此，目今的研究集中在快速开发疫苗和抗病毒药物以预防和治疗新冠状病毒熏染。
现在最有吸引力的抗病毒药物靶标之一是SARS-CoV编码的半胱氨酸卵白酶-木瓜卵白酶样卵白酶（PLpro），PLpro加入抑制细胞因子的爆发和趋化因子，认真抗病毒熏染，以是该酶是SARS-CoV抗病毒药物设计中的主要分子靶标。对CoV-2 PLpro底物特异性、结构和机制的分子相识，将通过举行合理的药物靶向设计和研究来极大地增进有用PLpro抑制剂的研发。
克日《Science》上揭晓了一篇最新研究，研究职员首先使用新颖的化学要领杂交组合底物库对SARS-CoV-2 PLpro举行了周全的活性剖析，效果展现了控制PLpro底物特异性的分子规则。使用这些信息，接下来设计了具有生化特征的有用抑制剂（VIR250和VIR251），与其他卵白酶相比，它们对SARS-CoV-2 PLpro和相关SARSCoV-1 PLpro具有高选择性。这项研究事情展现了控制PLpro底物特异性的分子纪律，并为开发具有潜在治疗价值或药物再使用的抑制剂提供了框架。
01
底物特异性概况
在P1位置的甘氨酸基侧的肽键水解会导致nsp1、nsp2和nsp3卵白的释放，这关于病毒复制至关主要。SARS-CoV-2 PLpro还具有去泛素化和识别这些卵白质C最后的守旧LRGG基序。先前仅针对包括自然氨基酸的组合底物库对SARS-CoV-1 PLpro底物偏好举行的研究，效果批注该卵白酶识别P4-P1位置的LXGG基序，在P3位置具有普遍的底物特异性。这些效果批注，对连系口袋结构更详细的作图应有助于新的活性底物的设计和用于抑制剂开发事情的最佳肽序列。为了实现这个目的，研究职员开发了一个界说的组合底物库（HyCoSuL），其中包括多种非卵白原性氨基酸。
SARS-CoV-1和2 PLpro卵白酶的活性剖析（泉源：Science Advances）
由于四肽荧光底物不可被具有去泛素化活性的酶有用地水解，因此研究职员设计并合成了具有Ac-LRXG-ACC和HyCoSuL的一样平常结构的P2界说文库。位置是牢靠的，一个位置包括19个氨基酸的等摩尔混淆物。通过设计具有针对去泛素酶的定制肽支架的文库，可以在剖析历程中抵达每个子库中单个荧光底物的最高可能浓度。
P2文库筛选显示，SARS-CoV和SARS-CoV-2 PLpro在此位置具有很高的底物特异性，两种卵白酶在P3位置均体现出普遍的底物偏好。SARS-CoV和SARS-CoV-2 PLpro的S3口袋不但可以耐受带正电的残基，并且还可以耐受疏水性氨基酸。这些酶无法识别酸性残基和大大都D-氨基酸。SARS-CoV和SARS-CoV-2 PLpro的S4口袋只能容纳疏水性残基，在自然氨基酸中，险些只能耐受亮氨酸。SARS-CoV PLpro在P4位置比亮氨酸更好地识别了两个非卵白残基。
02
PLpro抑制剂的开发
为了进一步剖析具有非卵白原性氨基酸的肽序列的选择性，研究职员通过交流荧光将两种底物转化为抑制剂标记一个反应性基团-乙烯基甲酯（VME）。选择VME组是由于它对DUB具有普遍的反应性，SARS-CoV PLpro和SARS-CoV-2 PLpro抑制剂的动力学剖析效果反应了底物水解的效果。与VIR250相比， VIR251对这些酶的抑制作用更强，但选择性更低。两种化合物均显示出对SARS-PLpro变体的高选择性，并能有用抑制SARS-CoV PLpro和SARS-CoV-2 PLpro活性。相反，现实上未视察到对人DUB UCH-L3的抑制，而仅视察到对MERS-PLpro的稍微抑制。别的，将HeLa裂解物与Ub-VME一起温育可爆发交联曲线，这种交联曲线不会因滴定VIR250或VIR251而改变。由于已知Ub-VME的主要交联靶标是人DUB酶，因此这些数据批注VIR250和VIR251不会与人DUB爆发交织反应，这是寻找与人DUB具有最小交织反应性的选择性抗病毒分子的主要发明。
与SARS-CoV-2 PLpro配合使用的非自然氨基酸抑制剂VIR250和VIR251及其晶体结构的表征（泉源：Science Advances）
接下来，研究职员着手确定SARS-CoV-2 PLpro与VIR250和VIR251的复合物的晶体结构，以深入相识这些分子抑制SARS-CoV-2 PLpro活性的分子机理，以及视察到的底物选择性的基础。大规模的交联反应爆发了CoV-2 PLpro-VIR250和CoV-2 PLpro-VIR251配合物，其产率和纯度足以知足衍射质量晶体的生长。
将载脂卵白CoV-2 PLpro与CoV-2 PLpro / VIR250和CoV-2 PLpro / VIR251配合物举行较量，发明除β14-β15环位于活性位点周围并履历构象转变外，总体结构相似可能是由于抑制剂的连系。结构剖析批注，从CoV-2 PLpro的催化Cys 111侧链投射出普遍的电子密度，其中VIR250和VIR251的所有原子都可以明确地安排在其中。别的，Cys 111之间的共价键VIR250和VIR251都清晰可见。如预期的那样，VIR250和VIR251抑制剂在活性位点周围均占有CoV-2 PLpro的S4-S1口袋并接纳类似的结构，P4位置是VIR250和VIR251之间唯一的化学差别区域，在VIR250中为Abu，在VIR251中为h Tyr。
03
VIR250和VIR251的分子识别
SARS-CoV-2 PLpro对VIR250和VIR251的分子识别（泉源：Science Advances）
VIR250和VIR251的P3和P4位置的侧链与CoV-2 PLpro的连系方法有主要区别。与VIR250中的Abu（Bth）相比，P4位置的hTyr向着S4口袋的另一侧突出。β14-β15环（Asn 267、Tyr 268和Gln 269）向VIR251的hTyr转移1.5-?，增进了这种新的相互作用，从而增进了许多新型的联系，而这些联系在没有这种转变的情形下是无法爆发的。值得注重的是，与VIR250和VIR251接触涉及的所有CoV-2 PLpro残基在SARS CoV-1 PLpro中都完全守旧，并且两个SARS PLpro变体的总体结构在酶的催化位点很是相似，这可能诠释了这些抑制剂具有靶向两种酶的能力。
就上述视察到的底物选择性的相关性而言，P2对Gly的依赖性是来自CoV-2 PLpro的β14-β15和α5-α6环残基的效果。对P3位置的正性和疏水性残基偏幸以及对酸性残基的选择可能是其更宽泛的口袋和靠近Tyr 268、Gln 269和Leu 162的酸性羰基氧的效果。在P4位置上，对重大的疏水残基的强烈偏幸可以通过P4连系口袋的疏水特征来诠释，该特征主要由残基Met 208、Pro 247、Pro 248、Tyr 264和Tyr 268形成。值得注重的是，SARS-CoV-2 PLpro的S4口袋的性子已被VIR250和VIR251的P4处的Abu和h Tyr侧链所使用。
04
CoV-1和CoV-2 PLpro处置惩罚Ub和Ubl变体
针对SARS-CoV-1 PLpro举行的研究批注，该酶具有Ub连系域，可有用处置惩罚完整的Ub荧光底物，因此研究职员想看看SARS-CoV-2 PLpro是否也是云云。为此使用了基于Ub活性的探针（ABP）来标记这两种酶。研究职员视察到生物素-Ub-VME对两种卵白酶都举行了实质性标记，其浓度是酶浓度（200 nM）的两倍。可是，与SARS-CoV-2 PLpro相比，SARS-CoV-1 PLpro的标记效率更高。接下来通过测试其与一组Ub / Ubl ABP的反应性来探索SARS-CoV-2 PLpro的Ub和Ubl卵白底物特异性，该剖析的效果批注SARS-CoV-2 PLpro更倾向于识别ISG15和monoUb，并且识别K48毗连的和K63毗连的diUb的能力较弱。
SARS-CoV-1 PLpro和SARS-CoV-2 PLpro对Ub和Ubl变体的处置惩罚（泉源：Science Advances）
为了更彻底地检查这些差别，研究职员对LRGG-ACC、Ub-ACC和ISG15-AMC荧光底物的SARS-CoV-1和CoV-2 PLpro加工动力学举行了较量。实验效果批注，SARS-CoV-2 PLpro处置惩罚Ub-ACC的效率是SARS-CoV-1 PLpro的四倍，并且SARS-CoV-2 PLpro处置惩罚ISG15-AMC的效率是Ub-ACC的60倍。别的，SARS-CoV-2 PLpro与SARS-CoV-1 PLpro一样，与K63 tetraUb相比，对K48 tetraUb的处置惩罚更为稳健。然而，在并排较量中，与SARS-CoV-1 PLpro相比，SARS-CoV-2 PLpro体现出显著降低了处置惩罚K48 tetraUb的能力。
思量到酶之间的很是高的总体相似性，与SARS-CoV-1 PLpro相比，SARS-CoV-2 PLpro处置惩罚K48 polyUb链的能力大大降低了。为了协调这种显着的矛盾，研究职员将SARS-CoV-2 PLpro结构与先前报道的SARS-CoV-1 PLpro结构与K48 diUb配合使用。对SARS-CoV-1和2 PLpro催化位点的较量剖析显示，与S1 Ub、VIR250和VIR251的S4-S1位置接触时所涉及的残基100％守旧，并且与预期结构很是相似。只管Ub S1位点比催化位点具有更大的变异性，但总体氨基酸守旧性仍然很高，并且结构在该区域排列得很好。
视察到的SARS-CoV-1 PLpro和SARS-CoV-2 PLpro的Ub / Ubl加工概况的分子基�。ㄈ� ；Science Advances））
与SARS-CoV-1 PLpro的催化位点和S1 Ub位点相比，SARS-CoV-2 PLpro的S2 Ub位点在氨基酸水平上的守旧性要低得多，并且在这些区域有一些结构差别关于分子识别S2 Ub很主要。研究职员以为SARS-CoV-2 PLpro处置惩罚K48 polyUb的能力下降的主要缘故原由是在S2 Ub连系位点的差别，与此假设一致，SARS-CoV-1 PLpro亮氨酸75突变为丝氨酸导致K48 diUb的连系镌汰了五倍，而对monoUb没有显着影响。连系SARS-CoV-2 PLpro中的其他转变，SARS-CoV-1和2 PLpro之间在S2连系位点泛起了一些相对较小的转变，这些转变对它们处置惩罚K48 polyUb的能力的影响很大。
05
效果与讨论
SARS-CoV-2 PLpro是抗病毒药物开发的绝佳候选者，由于它不但阻断病毒复制，并且还抑制熏染细胞中信号级联的失调。通过对药物靶向的合理设计和研究，对SARS-CoV-2 PLpro底物特异性、结构和机制的详细明确将极大地增进有用PLpro抑制剂的开发，这是此项研究的重点。
研究职员使用获得的有关控制SARS-CoV-2 PLpro底物选择性的分子规则的信息来开发共价抑制剂VIR250和VIR251。这些抑制剂被证实具有活性并选择性抑制SARS-CoV-1和-2 PLpro，但对MERS-PLpro的活性却弱得多，而对人DUB UCH-L3的活性则险些没有。关于举行针对该酶的肽类抗病毒化合物的研究，这是有价值的信息。VIR250和VIR251与SARS-CoV-2 PLpro配合使用的晶体结构展现了它们的抑制机制，并为视察到的底物特异性谱提供了却构基础。
别的，出乎意料的发明是，VIR250和VIR251的P4氨基酸占有了SARS-CoV-2 PLpro宽S4口袋的相对侧，并且该口袋中尚有其他区域未被任一抑制剂所连系，这意味着未来的药物开发事情旨在爆发更多有用的抑制剂。对SARS-CoV-2-Mpro和SARS-CoV-2 PLpro底物特异性的较量剖析批注，它们具有显着差别的底物特异性，这批注关于肽类抑制剂，不可能设计出一种同时作用于两种酶的抑制剂。可是，若是划分为这两种卵白酶找到了肽类抑制剂，那么有可能需要将它们用作混淆物。另一种可能的要领是寻找可以同时抑制Mpro和PLpro的小分子抑制剂，这种抑制剂在COVID-19的治疗中一定会很是有益，但它可能与人半胱氨酸卵白酶爆发交织反应，从而可能导致不良副作用。
结构剖析显示，SARS-CoV-2 PLpro的S2 Ub连系位点保存细微的结构和序列变异，研究职员配合以为这会削弱K48 polyUb的S2 Ub连系及随后被加工的能力。别的，对Ub-ACC底物的酶动力学剖析批注，该酶可以有用地对其举行处置惩罚，可是在SARS-CoV-1 PLpro的情形下，四肽底物和Ub之间的差别仅为10倍左右。这批注两种酶之间在外位连系区相互作用的方面与氨基酸的统一性和相似性有些差别。鉴于Ub和ISG15偶联在逃避宿主先天免疫反应中的作用，SARS-CoV-1和-2 PLpro功效的这些有趣差别是否会对病毒生物学爆发任何影响尚待视察，并且将是未来研究的主题。
总的来说，此项研究事情展现了控制PLpro底物特异性的分子规则，并展现了底物连系口袋中SARS-CoV-1和-2 PLpro之间很是高的序列和结构相似性。这些发明批注，先前发明的有关SARS-CoV-1 PLpro的信息可连忙用于寻找有用的抗病毒分子，并重新靶向抑制SARS-CoV-2 PLpro的已知药物。别的，与SARS-CoV-2 PLpro连系的新型抑制剂VIR250和VIR251的结构为合理开发具有增强效价和ABP的抑制剂提供了框架。此项研究的谱图和晶体学研究为开发性能改善的抑制剂开发了新途径，研究数据也为设计一种可以同时对抗SARS-CoV-1 PLpro和SARS-CoV-2 PLpro的全选择性抑制剂提供了资助。尊龙凯时作为新药研发CRO会一连关注此项研究希望。
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