SARS-CoV-2是一种有包膜的单链RNA 病毒，病毒RNA通过核糖体移码爆发两个多聚卵白：pp1a和pp1ab。多卵白由木瓜卵白酶样卵白酶（PL pro）处置惩罚，其切割3个位点释放非结构卵白nsp1-3和一种3C样卵白酶，也称为主要卵白酶（M pro）。在11个位点切割以释放非结构卵白，这些非结构卵白形成复制酶复合体，认真病毒基因组的复制和转录，因此使得M pro和PL Pro成为抗病毒药物开发的主要目的。
结构生物学可以起到药物开发的要害作用，但直接靶向SARS-CoV-2的药物仍然令人难以捉摸。克日，《Nature Communications》上的一篇新论文概述了一个国际研究团队怎样确定潜在的要领，以快速设计出与COVID-19对抗的刷新且功效更强的化合物。研究职员通过连系质谱和X射线要领对SARS-CoV-2主卵白酶举行了大规模的亲电试剂和非共价片断筛选病毒复制，晶体学屏幕确定了笼罩整个运动位点的71个匹配以及二聚体界面的3个匹配。这些组合提供了亘古未有的结构和反应性信息，可用于正在举行的针对SARS-CoV-2主卵白酶结构的药物设计。
Part 1
M pro以无配体形式结晶，衍射至靠近原子区分率
不含配体的M pro的晶体结构适合X射线片断筛�。ㄈ矗篘ature Communications）
晶体形式很是适合晶体碎片筛查，只管卵白晶体的溶剂百分比很是低，可是仍然保存清晰的通道可以通过扩散进入活性位点。别的，当向结晶液滴中添加可消融的碎片时，细密群集和牢靠的先天衍射平均晶体可对抗晶格破损和DMSO溶剂对衍射的降解。
Part 2
连系MS和晶体学碎片筛查展现了M pro的新连系剂
结晶碎片屏幕的时间线（泉源：Nature Communications）
为了确定共价起点，研究职员使用完整卵白质谱法筛选了先前形貌的针对Mpro的约1000个轻度亲电片断库。含有化合物N-（chloroacetyl）aniline基序是频仍击打者，由于这样的化合物是高反应性的。因此，研究职员选择反应性相对较低的系列成员举行后续结晶实验，关于包括N-氯乙�；哙せ�-4-羧酰胺基序的另一系列掷中化合物，它们显示较低的反应性并且在以前的筛选中不经常爆发击打。
虽然温顺的亲电片断很是适合探测活性位点半胱氨酸周围的连系特征，但它们的小尺寸却阻止了对底物连系的普遍探索。研究职员举行了另一次晶体学碎片筛查，以详尽地探查Mpro活性位点，并寻找碎片合并或生长的时机。将68个亲电子片断掷中以及来自7个文库的总共1176个奇异片断添加到晶体中，非共价片断被浸泡，而亲电试剂片断既被浸泡又被共结晶，以确保在结构上视察到尽可能多的质谱图。总共1742次浸泡和1139次共结晶实验爆发了1877个镶嵌晶体，只管有些碎片破损了晶体或衍射，但仍然网络到了1638个区分率高于2.8?的数据集。
Part 3
非共价片断掷中展现了活性位点中的多个可靶向亚位点
研究职员共判断出八个片断连系在S1亚位点上，并通过吡啶环或类似的含氮杂环与要害残基的侧链形成相互作用，通过酰胺或脲部分中的羰基与Glu166形成相互作用。与其他亚位点相比，亚位点S2先前已显示出更大的无邪性，可顺应肽基抑制剂中较小的取代基，但会优先选择亮氨酸或其他疏水残基。许多片断在此位置连系，研究职员称其为“芳香轮”，是由于芳香环的一致基序与Met49形成疏水相互作用，或与His41形成π-π群集，基团划分在4个轴向上安排。
连系的片断对运动位点举行了周全采样（泉源：Nature Communications）
在探索亚位点S3的四个片断中，其中三个片断带有一个磺酰胺基的芳环，该磺酰胺基与Gln189形成氢键，并朝着溶剂界面指向活性位点，这些掷中具有适合使用上述相同的His164 / Met165 / Asp187口袋的扩展载体。
已经确定，关于类似的病毒卵白酶如SARS-CoV的-1卵白酶的生物学单位是二聚体，并且在突变二聚体界面可以破损卵白酶活性，因此滋扰二聚化的化合物可能充当卵白酶活性的准变构抑制剂。在这项研究中，三种化合物连系在二聚体界面的可及位置，可以想象到使用它们来设计化合物来破损M pro二聚体。
二聚体界面的片断体现变构调理的时机（泉源：Nature Communications）
片断Z1849009686（×1086）连系在由Met6、Phe8、Arg298和Val303的侧链形成的疏水口袋中，它还介导了两个氢键与Gln127的侧链和Met6的骨架。Z264347221（×1187）类似地连系在由Met6，Phe8和Arg298制成的疏水性口袋中，延伸穿过二聚体界面以与第二个原发性卵白的Ser123、Tyr118和Leu141相互作用，包括氢键Ser123的侧链和主干。最后是POB0073（x0887），在二聚体界面处仅与Gly2连系4?，被包裹在一个前体的Lys137和Val171之间，而另一个包裹在Gly2、Arg4、Phe3、Lys5和Leu282之间，包括两个与Phe3骨架相连的氢键。
Part 4
共价片断掷中展现了几个易处置惩罚的系列
在所有具有亲电试剂连系的结构中，N-氯乙�；驶踉佑隚ly143、Ser144或Cys145的骨架酰胺氢形成两个或三个氢键，包括N-氯乙�；哙せ�-4-羧酰胺基序的所有三种化合物都接纳类似的指向S2口袋的连系方法。
共价片断锚定在Cys145处并取样正构M pro连系袋的差别区域（泉源：Nature Communications）
一系列含有N-氯乙�；哙せ�-4-羧酰胺基序的化合物显示出了有前途的连系模式。为了跟踪这些化合物，研究职员举行了第二代化合物的快速合成。通过N-氯乙�；哙�-4-羰基氯与种种内部胺（优选带有发色团以简化纯化）的反应，可以以毫克级获得这种化学型的衍生物。这些新化合物通过完整卵白质质谱法测试，以评估卵白质标记。源自非极性胺的酰胺大多胜过其极性对应物，这体现了在该偏向上可靶向的亲脂性亚区域。两种具有最高标记的PG-COV-35和PG-COV-34的酰胺突出显示了划分通过酰胺N-烷基化或交织偶联进一步合成衍生化的潜力。
突出显示的结构-活性关系关于进一步优化很主要。溴炔具有固有的硫醇反应性，它比已建设的基于丙烯酰胺的共价抑制剂的固有硫醇反应性低。炔烃的几何形状及其连系方法也批注，可以用可逆的共价基团（例如腈）取代，它可以通过相同的非共价相互作用举行指导。两个共价掷中物（2-氰基嘧啶和2-氰基咪唑）来自小型杂环亲电子试剂库，它们实质上是由五元和六元氮组成，含具有吸电子特征的杂环，可激活小的亲电子取代基（卤素，乙基，乙烯基和腈基）。
Part 5
效果与讨论
本研究提供的数据为从SARS-CoV-2开发有用的M pro抑制剂提供了许多明确的途径。连系的片断周全采样了活性位点的所有子位点，展现了差别的扩增载体，并且亲电试剂为设计共价化合物提供了系统的和无意的普遍数据。人们普遍以为，新的小分子药物不可以足够快的速率开发出来以资助对抗COVID-19。然而，由于大盛行病威胁仍将是一个恒久问题，并且候选疫苗不可包管提供周全和长期的�；�，因此抗病毒分子将仍然是主要的防御线，这类化合物还需要与未来的盛行病作斗争，此项研究得出的数据将加速此类事情希望。
总的来说，共价掷中提供了低反应性和高选择性抑制剂的合理途径。合理设计的共价药物获得牵引力，许多最近FDA批准的药物，它们的设计是基于很是有用的非共价连系，即允许低反应性亲电的准确定位，以是共价键的形成即是连系位点特异性的依赖。碎片要领已成为现代药物发明的一种主要要领，使用了少量化合物（ < 300Da）的小荟萃 （100s或1000s ），这些化合物杂乱地连系在一起，因此比HTS获得的化学空间要大得多。面临的挑战是，片断击中的连系很是弱，需要高度迅速的生物物理检测，对连系的仔细确认以及专业的化学知识才华将这些击中并生长为完全有用的候选药物。但真正的希望是可以将它们快速有用地转化为有用的候选药物，并通过更简朴的途径将其转化为临床药物。
天下上的焦点一直放在疫苗和现有药物的再使用上，可是该项研究是少数实验新型小分子疗法的项目之一。该研究团队接纳了极为差别寻常的途径，即在天生所有实验数据后连忙将其宣布，因此效果将可供全球任何一家药品制造商使用。国际社会对此项研究数据实时宣布的反应更为精彩，纷纷调动了大宗的专业知识、手艺和慈善事业，并演酿成一种奇异而严酷的药物发明事情旨在迅速开发出具有优异清静性和临床前特征的的口服抗病毒药物。尊龙凯时作为新药研发CRO也会一连关注此项研究希望。
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